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Pannek, Martin:
Biochemical and structural studies on the mitochondrial Sirtuins 4 and 5.
Bayreuth
,
2018
. - 231 S.
(
Dissertation,
2018
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
Volltext
Angaben zu Projekten
| Projektfinanzierung: |
Deutsche Forschungsgemeinschaft Oberfrankenstiftung |
|---|
Abstract
The Sirtuins constitute a conserved enzyme family, which is involved in the regulation of fun-damental cellular processes like metabolic homeostasis, DNA repair or aging. In this context, they were linked to multiple aging-related pathologies such as neurodegenerative diseases and cancer. Sirtuins catalyze the NAD+-dependent hydrolysis of posttranslational acyl-modifications from protein lysine side chains. Mammalian cells possess seven Sirtuin isoforms (Sirt1 7), which are primarily located to either the nucleus/nucleolus (Sirt1/6/7), cyto-sol (Sirt2) or mitochondria (Sirt3/4/5). While lysine deacetylation was initially supposed to be the conserved function of all Sirtuins, recent research has revealed a broader range of lysine deacylase activities, like demyristoylation by Sirt6 or desuccinylation by Sirt5. Of the mito-chondrial Sirtuins, Sirt3 is a robust deacetylase, while no efficient Sirt4 activity was reported so far. Also the acyl-specificity of Sirt5, albeit identified as desuccinylase/demalonylase, was never systematically characterized. However, investigating Sirtuin catalysis, their influence on substrate proteins and relation to organismal pathophysiology demands precise knowledge about Sirtuin acyl-specificity. Notably, specific Sirtuin modulators provide another possibility for characterizing Sirtuins in vitro and in vivo and have a potential in prospective medical treatments of Sirtuin-related dysfunctions like type 2 diabetes (Sirt4) or neurodegeneration (Sirt2/5). However, only a few specific Sirtuin modulators were developed yet.
In this thesis, the acyl specificities of the mitochondrial Sirtuins 4 and 5 were investigated in collaborative projects. Our collaborators synthesized an acyl-peptide library to screen Sirt5 activity, which revealed a superior lysine deglutarylation efficiency compared to the reported desuccinylase/demalonylase activities. We solved crystal structures of Sirt5 in complex with several acylated peptides to elucidate the molecular background of these activities. Suppos-edly, the more strained conformation of the glutaryl-ADP-ribose product is responsible for the improved turnover by enhancing the rate-limiting product release. Concerning Sirt4, we screened activities with the same acyl-peptide library and identified the hydrolysis of 3,3-dimethyl-succinyl as a robust, but unphysiologic activity. Testing chemically similar acyls with a physiologic background revealed 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl as a robust Sirt4 substrate acyl.
Furthermore, this work includes the first Sirt4 crystal structures obtained by using the orthologue Xenopus tropicalis Sirt4, which shares a high sequence identity and the same cat-alytic activities with the human isoform. These crystal structures revealed three interesting features providing deeper insights into the function and regulation of Sirt4. Firstly, Sirt4 com-prises a significantly elongated zinc-binding domain loop, which sequence is present in all chordate Sirt4, but unique in the Sirtuin family. It contributes to the active-site lining and might be involved in Sirt4 regulation, since loop mutants showed changed catalytic turnovers. Sec-ondly, the nucleotide-binding pocket is more positively charged compared to other isoforms, which appears to correlate with a unique sensitivity among Sirtuins to physiologic NADH con-centrations, indicating a distinct regulation mechanism for Sirt4. Thirdly, an additional channel to the acyl-lysine binding site was identified, which might either expand the substrate acyl-lysine binding pocket or serve as a binding-site for regulatory molecules.
We utilized the insights in Sirt5 structure and function to develop specific small molecule inhib-itors in collaborative projects. Our contribution to these projects was the analysis of complex crystal structures to guide the inhibitor synthesis and kinetic studies performed by our collabo-rators. We chose a peptide with succinyl-lysine as a starting point and transformed this robust and Sirt5-specific substrate into Sirt5-selective peptide inhibitors by derivatization of the suc-cinyl with alkyl-side chains. These inhibitory peptides initially showed weak potencies in the two-digit micromolar range and competed with NAD+ binding through the alkyl moieties as revealed by structural analysis. We rationally derivatized these inhibitors by substitution of the alkyl-side chains with thio-alkyls, which increased potency into the two-digit nanomolar range and showed a similar inhibitory mechanism in structural analysis. Since peptidic inhibitors of-ten comprise poor cellular resorption and half-life, the strongest inhibitory acyl was attached to a lysine or lysine-mimetics to create small molecule modulators, but resulted in a decrease of potency by at least three orders of magnitude. However, we could obtain structural infor-mation about inhibitor scaffold-optimization in another collaborative structure-activity relation-ship study, which pursued a Sirtuin mechanism-based inhibition approach. Herein, short pep-tide( like) inhibitors were developed and structurally analyzed, which resulted in potencies in the sub-micromolar range. Combining this information about Sirt5 affinity hot spots around the lysine binding-site with the inhibitory acyls of the peptide approach should constitute a starting point for the development of small molecule Sirt5 inhibitors. These will contribute to the eluci-dation of Sirt5 physiology and have a potential as therapeutics for the treatment of Sirt5-related diseases.
Abstract in weiterer Sprache
Die Sirtuine sind eine konservierte Familie von Enzymen, welche in die Regulation fundamen-taler zellulärer Prozesse wie der metabolischen Homöostase, der Aufrechterhaltung der ge-nomischen Stabilität oder dem Altern involviert ist. In diesem Zusammenhang wurden die Sirtuine mit mehreren alterungsbedingten Pathologien wie neurodegenerativen Krankheiten und Krebs in Verbindung gebracht. Sirtuine katalysieren die NAD+-abhängige Hydrolyse von posttranslationalen Acyl-Modifikationen von Protein Lysin Seitenketten. Wirbeltiere weisen sieben Sirtuin Isoformen auf (Sirt1-7), welche primär im Nukleus/Nukleolus (Sirt1/6/7), dem Zellplasma (Sirt2) oder den Mitochondrien (Sirt3/4/5) lokalisiert sind. Während die Hydrolyse von Lysin-Acetylierungen zunächst als konservierte Funktion aller Sirtuine angesehen wurde, offenbarten neuere Studien, dass Sirtuine eine größere Bandbreite von Lysin-Deacylase Akti-vitäten aufweisen, wie die Demyristoylierung durch Sirt6 oder Desuccinylierung durch Sirt5. Von den mitochondrialen Sirtuinen ist Sirt3 als effiziente Deacetylase bekannt, wohingegen für Sirt4 bislang keine robuste Aktivität beschrieben wurde und die Sirt5 Acyl-Spezifität nach Entdeckung ihrer Demalonylase/Desuccinylase Aktivität nie umfassend charakterisiert wur-de. Die detaillierte Kenntnis der Acyl-Präferenz ist jedoch essentiell für die Untersuchung der Sirtuin Katalyse, den Einfluss der Sirtuine auf ihre Substrat-Proteine und deren Zusammen-hang mit der Pathophysiologie des Organismus. Bei solchen Untersuchungen spielen wirk-same und Isoform-spezifische Sirtuin-Modulatoren eine bedeutende Rolle, da sie eine weitere Option für die in vitro und in vivo Charakterisierung der Sirtuine darstellen. Zusätzlich sind solche Modulatoren potentielle Therapeutika für Krankheiten, welche in Zusammenhang mit Sirtuinen stehen, wie neurodegenerative Erkrankungen (Sirt2/5) oder Typ 2 Diabetes (Sirt4). Allerdings sind bislang nur wenige spezifische Modulatoren für Sirtuine bekannt.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die Acyl-Spezifitäten der mitochondrialen Sirtuine 4 und 5 in Kollaborationsprojekten untersucht. Unsere Kollaborateure synthetisierten eine Acyl-Peptid Bibliothek zur systematischen, kinetischen Charakterisierung der Sirt5 Acyl-Spezifität und entdeckten eine gesteigerte Lysin Deglutarylierungs-Effizienz gegenüber den zuvor be-richteten Demalonylase und Desuccinylase Aktivitäten. Durch Lösen von Sirt5 Kristallstruktu-ren in Komplex mit verschiedenen acylierten Peptiden wurde der molekulare Hintergrund dieser Aktivitäten analysiert. Diese legten die Hypothese nahe, dass die effizientere Lysin Deglutarylierung von der stärkeren Stauchung des Glutaryl-ADP-Ribose Produktes rührt, welche die Katalyse-Geschwindigkeit limitierende Produkt-Freisetzung beschleunigen könnte. Die generierte Acyl-Peptid Bibliothek ermöglichte es uns weiterhin, die Acyl-Spezifität von Sirt4 zu charakterisieren, wodurch die Hydrolyse von 3,3-Dimethyl-Succinyl von Lysinen als robuste, aber unphysiologische Sirt4 Aktivität identifiziert wurde. Durch Experimente mit chemisch ähnlichen, potentiell physiologischen Acylen konnte die Hydrolyse von 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl von Lysin Seitenketten als robuste Sirt4 Aktivität gezeigt werden.
Die vorliegende Arbeit beinhaltet zudem die ersten Kristallstrukturen von Sirt4, welche unter Verwendung des Xenopus tropicalis Sirt4 Orthologs gelöst werden konnten. Dieses Ortholog weist eine hohe Sequenzidentität zur humanen Isoform und dieselben enzymatischen Aktivi-täten auf. Die Kristallstrukturen zeigten drei besondere Merkmale von Sirt4, welche zum bes-seren Verständnis dieser Isoform beitragen. Erstens besitzt die Zink-Bindedomäne einen ver-hältnismäßig langen Loop, dessen Sequenz konserviert in Chordata Sirt4 Orthologen, aber einzigartig in der Sirtuin-Familie ist. Dieser steuert Aminosäuren zum Aufbau des Aktivzent-rums bei und scheint in die Regulation der Enzymaktivität involviert zu sein, da Loop-Deletionsmutanten veränderte katalytische Werte zeigten. Zweitens weißt die Nukleotid-Bindetasche eine positivere elektrostatische Ladung auf, was die unter den Sirtuinen einzigar-tige Sensitivität gegenüber physiologischen NADH-Konzentrationen erklären könnte. Drittens zeigen die Strukturen einen zusätzlichen Kanal zum Aktivzentrum, welcher als vergrößerte Substrat Acyl-Lysin Bindestelle oder als Interaktionsfläche für regulatorische Moleküle dienen könnte.
Die Einblicke in die Struktur und Funktion von Sirt5 flossen in die Entwicklung spezifischer Modulatoren für diese Isoform ein. Unser Beitrag war die Analyse von Komplex Kristallstruk-turen, um die Inhibitor-Synthese und kinetischen Studien unserer Partner rational zu führen. Dafür wählten wir ein Peptid mit succinyliertem Lysin als Startpunkt und transformierten die-ses robuste und Sirt5-spezifische Substrat durch Derivatisierung des Succinyls mit Alkyl-Seitenketten in Sirt5-selektive Peptid-Inhibitoren. Die zunächst schwachen Inhibitoren mit Wirksamkeiten im zweistelligen mikromolaren Bereich zeigten in den strukturellen Analysen eine Kompetition der Alkyl-Seitenketten mit dem Co-Substrat NAD+. Durch rationale Derivati-sierung des Succinyls mit Thio-Alkylen konnte die Wirksamkeit der Peptid-Inhibitoren jedoch in den zweistelligen nanomolaren Bereich verbessert werden, wobei diese Derivate den glei-chen inhibitorischen Mechanismus in strukturellen Analysen zeigten. Durch Abtrennen des Peptids sollte der Schritt zu niedermolekularen Wirkstoffen vollzogen werden, um deren zellu-läre Resorption und Halbwertszeit zu verbessern. Allerdings verringerte dies die Wirksamkeit um mindestens drei Größenordnungen, je nach Derivatisierung des inhibitorischen Acyls mit verschiedenen Lysin-Mimetika. In einer weiteren kollaborativen Studie, welche einen Sirtuin-Mechanismus basierten Ansatz der Inhibition verfolgte, wurden kleinere Peptid(-Mimetika) mit Wirksamkeiten im sub-mikromolaren Bereich entwickelt und strukturelle Informationen zur Optimierung des Inhibitor-Rückgrats rund um die Bindung im Lysin Kanal gewonnen. Die Kombination der Erkenntnisse über Affinitäts-Hotspots am Lysin-Kanal mit den Acylen aus dem Peptid-Inhibitoren Ansatz ergibt einen Startpunkt zur Entwicklung potenter und selektiver Sirt5 Kleinmolekül-Inhibitoren. Diese werden einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung der Sirt5 Physiologie leisten und besitzen Potential als Therapeutika für die Behandlung von Krankhei-ten, welche in Zusammenhang mit Sirt5 stehen.